Technologia peptydów FRET

Transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET)

Fluorescencyjny rezonansowy transfer energii (FRET) to niepromienisty proces przenoszenia energii, w którym energia stanu wzbudzonego donora jest przenoszona do stanu wzbudzonego akceptora poprzez oddziaływanie międzycząsteczkowych par elektrycznych.W procesie tym nie biorą udziału fotony i dlatego nie jest on radioaktywny.Test ten ma tę zaletę, że jest szybki, czuły i prosty.

Barwnik stosowany w teście FRET może być identyczny.Jednak w większości zastosowań faktycznie stosuje się różne barwniki.W skrócie, przeniesienie świetlistej energii rezonansowej polega na przeniesieniu pary dipoli z dawcy (barwnik 1) do akceptora (barwnik 2), gdy grupa dawcy jest wzbudzona.Ogólnie widmo emisji grupy fluoroforów donorowych pokrywa się z widmem absorpcji grupy akceptorowej.„Gdy odległość między dwoma fluoroforami jest odpowiednia (10–100 A), można zaobserwować transfer energii fluoroforu od donora do akceptora.”Sposób przekazywania energii zależy od budowy chemicznej receptora:

1. Zamienia się w wibracje molekularne, to znaczy zanika świetliste światło przenoszenia energii.(Receptor wygasza światło)

2. Emisja jest bardziej intensywna niż sam receptor, co powoduje przesunięcie ku czerwieni we wtórnym widmie fluorescencji.”(Receptory są emiterami światła).

Grupa dawcy (EDANS) i gen akceptorowy (DABCYL) są jednolicie połączone z naturalnym substratem proteazy HIV, a gdy substrat nie jest odłączony, DABCYL może stłumić EDANS, a następnie stać się niewykrywalnym dla fluoru.Po odłączeniu proteazy HIV-1, EDANS nie jest już tłumiony przez DABCYL i można następnie wykryć lucyferazy EDANS.Dostępność inhibitorów proteaz można monitorować poprzez zmiany intensywności fluorescencji EDANS.

Peptydy FRET są wygodnymi narzędziami do badania niespecyficzności peptydazy.Ponieważ proces reakcji można stale monitorować, stanowi wygodną metodę wykrywania aktywności enzymu.Połysk powstający po hydrolizie wiązań peptydowych przez donora/akceptora stanowi miarę aktywności enzymu w stężeniach nanomolowych.Gdy peptyd FRET jest nienaruszony, wykazuje nagły zanik wewnętrznego błysku, ale gdy pęknie jakiekolwiek wiązanie peptydowe naprzeciwko donora/akceptora, uwalnia się błysk, który można wykryć w sposób ciągły, a następnie można określić ilościowo aktywność enzymu.