Zasada działania i przygotowanie substratu tripeptydu/endotoksyny odczynnika Limulus

Tripeptyd odczynnika Limulus jest substancją tripeptydową o określonej sekwencji ekstrahowaną z lizatu komórek krwi kraba podkowiastego lub sztucznie syntetyzowaną. Tripeptyd odczynnika Limulus jest chromogennym substratem stosowanym do analiz ilościowych (takich jak test na endotoksyny bakteryjne) w celu wykrywania i pomiaru składników bakterii Gram-ujemnych—endotoksyny. Pod wpływem enzymów aktywowanych przez endotoksyny uwalnia się barwny związek (taki jak p-nitroanilina), co umożliwia pomiar intensywności zabarwienia i korelację z zawartością endotoksyn.

Zasada działania

Aktywacja endotoksyn: W obecności endotoksyn amebocyty we krwi kraba podkowiastego uwalniają enzymy, uruchamiając w ten sposób kaskadę krzepnięcia.

Działanie enzymu: Aktywowany enzym (zwykle enzym krzepnięcia) działa następnie na substrat chromogenny.

Reakcja chromogenna: Enzym rozszczepia substrat, uwalniając żółty związek zwany p-nitroaniliną (pNA).

Analiza ilościowa: Intensywność żółtego zabarwienia jest proporcjonalna do zawartości endotoksyn w próbce i jest zwykle mierzona za pomocą spektrofotometru przy absorbancji 405 nm.

Metody przygotowania

Tripeptyd odczynnika Limulus można otrzymać dwoma sposobami przygotowania.

1. Ekstrakcja naturalnych składników z komórek krwi Limulus i otrzymanie aktywnego tripeptydu poprzez separację i oczyszczenie.

2. Wykorzystanie technologii syntezy w fazie stałej do sekwencyjnego łączenia określonych sekwencji aminokwasów, precyzyjnie kontrolując strukturę tripeptydu.

Ze względu na politykę ochrony Limulusa (w prowincjach takich jak Zhejiang, Fujian, Guangdong i Guangxi wymienia się go jako „kluczową dla prowincji chronioną faunę wodną” / Hongkong wydał pod koniec 2012 r. przepisy zakazujące połowu włokiem dennym) oraz ponieważ proces wydobycia jest złożony i wymagający, koszt pierwszej metody jest stosunkowo wysoki. Dlatego obecnie powszechnie stosuje się syntezę w fazie stałej. Łącząc sekwencyjnie określone sekwencje aminokwasów, można precyzyjnie kontrolować strukturę tripeptydu. Metoda ta nie tylko zapewnia stabilność i konsystencję produktu, ale także pozwala na produkcję na dużą skalę, zaspokajając potrzeby przemysłu farmaceutycznego w zakresie testowania odczynników.