Peptydy to klasa związków utworzonych przez połączenie wielu aminokwasów poprzez wiązania peptydowe.Są wszechobecne w organizmach żywych.Do chwili obecnej w żywych organizmach odkryto dziesiątki tysięcy peptydów.Peptydy odgrywają ważną rolę w regulowaniu czynności funkcjonalnych różnych układów, narządów, tkanek i komórek oraz w czynnościach życiowych i są często wykorzystywane w analizie funkcjonalnej, badaniach nad przeciwciałami, opracowywaniu leków i innych dziedzinach.Wraz z rozwojem biotechnologii i technologii syntezy peptydów opracowano i zastosowano w klinice coraz więcej leków peptydowych.
Istnieje szeroka gama modyfikacji peptydów, które można po prostu podzielić na modyfikacje końcowe i modyfikacje procesowe (przy użyciu modyfikacji pochodnych aminokwasów) oraz modyfikacje N-końcowe, modyfikacje C-końcowe, modyfikacje łańcuchów bocznych, modyfikacje aminokwasów, modyfikacje szkieletu, itp., w zależności od miejsca modyfikacji (Rysunek 1).Jako ważny sposób zmiany struktury głównego łańcucha lub grup łańcuchów bocznych łańcuchów peptydowych, modyfikacja peptydów może skutecznie zmienić właściwości fizyczne i chemiczne związków peptydowych, zwiększyć rozpuszczalność w wodzie, wydłużyć czas działania in vivo, zmienić ich rozkład biologiczny, wyeliminować immunogenność , zmniejszają toksyczne skutki uboczne itp. W tym artykule przedstawiono kilka głównych strategii modyfikacji peptydów i ich charakterystykę.
1. Cyklizacja
Peptydy cykliczne mają wiele zastosowań w biomedycynie, a wiele naturalnych peptydów o aktywności biologicznej to peptydy cykliczne.Ponieważ peptydy cykliczne są zwykle sztywniejsze niż peptydy liniowe, są wyjątkowo odporne na układ trawienny, mogą przetrwać w przewodzie pokarmowym i wykazują silniejsze powinowactwo do receptorów docelowych.Cyklizacja jest najbardziej bezpośrednią metodą syntezy peptydów cyklicznych, zwłaszcza peptydów o dużym szkielecie strukturalnym.Zgodnie z trybem cyklizacji można go podzielić na typ łańcucha bocznego, typ typu terminal - łańcuch boczny, typ terminal - typ terminala (typ od końca do końca).
(1) łańcuch boczny do łańcucha bocznego
Najbardziej powszechnym typem cyklizacji łańcucha bocznego do łańcucha bocznego jest mostkowanie dwusiarczkowe pomiędzy resztami cysteiny.Ta cyklizacja jest wprowadzana przez odbezpieczenie pary reszt cysteiny, a następnie utlenienie, tworząc wiązania disiarczkowe.Syntezę policykliczną można osiągnąć przez selektywne usuwanie sulfhydrylowych grup zabezpieczających.Cyklizację można przeprowadzić w rozpuszczalniku po dysocjacji lub na żywicy przed dysocjacją.Cyklizacja na żywicach może być mniej skuteczna niż cyklizacja rozpuszczalnikiem, ponieważ peptydy na żywicach nie tworzą łatwo konformacji cyklizowanych.Innym rodzajem cyklizacji łańcuch boczny - łańcuch boczny jest tworzenie struktury amidowej pomiędzy resztą kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowego a aminokwasem zasadowym, co wymaga, aby grupa zabezpieczająca łańcuch boczny mogła być selektywnie usunięta z polipeptydu na żywicy lub po dysocjacji.Trzeci rodzaj cyklizacji łańcuch boczny - łańcuch boczny to tworzenie eterów difenylowych przez tyrozynę lub p-hydroksyfenyloglicynę.Ten rodzaj cyklizacji w produktach naturalnych występuje wyłącznie w produktach mikrobiologicznych, a produkty cyklizacji często mają potencjalną wartość leczniczą.Otrzymywanie tych związków wymaga unikalnych warunków reakcji, dlatego nie są one często stosowane w syntezie konwencjonalnych peptydów.
(2) od terminala do łańcucha bocznego
Cyklizacja łańcucha po stronie końcowej zwykle obejmuje koniec C z grupą aminową łańcucha bocznego lizyny lub ornityny lub koniec N z łańcuchem bocznym kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowego.Inną cyklizację polipeptydów przeprowadza się przez utworzenie wiązań eterowych pomiędzy terminalem C a łańcuchami bocznymi seryny lub treoniny.
(3) Typ końcowy lub typu head-to-tail
Polipeptydy łańcuchowe można poddać cyklizacji w rozpuszczalniku lub utrwalić na żywicy poprzez cyklację łańcucha bocznego.W centralizacji rozpuszczalników należy stosować niskie stężenia peptydów, aby uniknąć oligomeryzacji peptydów.Wydajność syntetycznego polipeptydu pierścieniowego typu „od głowy do ogona” zależy od sekwencji polipeptydu łańcucha.Dlatego przed przygotowaniem peptydów cyklicznych na dużą skalę należy najpierw stworzyć bibliotekę możliwych łańcuchowych peptydów wiodących, a następnie przeprowadzić cyklizację w celu znalezienia sekwencji dającej najlepsze rezultaty.
2. N-metylacja
N-metylacja pierwotnie występuje w naturalnych peptydach i jest wprowadzana do syntezy peptydów, aby zapobiec tworzeniu się wiązań wodorowych, dzięki czemu peptydy są bardziej odporne na biodegradację i klirens.Najważniejszą metodą jest synteza peptydów z wykorzystaniem N-metylowanych pochodnych aminokwasów.Ponadto można również zastosować reakcję Mitsunobu półproduktów polipeptydowych-żywicy N-(chlorku 2-nitrobenzenosulfonylu) z metanolem.Metodę tę zastosowano do przygotowania cyklicznych bibliotek peptydów zawierających N-metylowane aminokwasy.
3. Fosforylacja
Fosforylacja jest jedną z najczęstszych modyfikacji potranslacyjnych w przyrodzie.W komórkach ludzkich ponad 30% białek ulega fosforylacji.Fosforylacja, zwłaszcza odwracalna, odgrywa ważną rolę w kontrolowaniu wielu procesów komórkowych, takich jak przekazywanie sygnału, ekspresja genów, regulacja cyklu komórkowego i cytoszkieletu oraz apoptoza.
Fosforylację można zaobserwować przy różnych resztach aminokwasowych, ale najczęstszymi celami fosforylacji są reszty seryny, treoniny i tyrozyny.Pochodne fosfotyrozyny, fosfotreoniny i fosfoseryny można wprowadzać do peptydów podczas syntezy lub tworzyć po syntezie peptydów.Selektywną fosforylację można osiągnąć stosując reszty seryny, treoniny i tyrozyny, które selektywnie usuwają grupy zabezpieczające.Niektóre odczynniki do fosforylacji mogą również wprowadzać grupy kwasu fosforowego do polipeptydu w drodze późniejszej modyfikacji.W ostatnich latach specyficzną dla miejsca fosforylację lizyny osiągnięto za pomocą chemicznie selektywnej reakcji Staudingera z fosforynem (ryc. 3).
4. Mirystoilacja i palmitoilacja
Acylacja N-końca kwasami tłuszczowymi umożliwia peptydom lub białkom wiązanie się z błonami komórkowymi.Myridamoilowana sekwencja na N-końcu umożliwia nakierowanie kinaz białkowych z rodziny Src i białek Gaq na odwrotną transkryptazę w celu związania się z błonami komórkowymi.Kwas mirystynowy połączono z N-końcem polipeptydu żywicy, stosując standardowe reakcje sprzęgania, a powstały lipopeptyd można było zdysocjować w standardowych warunkach i oczyścić metodą RP-HPLC.
5. Glikozylacja
Glikopeptydy, takie jak wankomycyna i teilanina, są ważnymi antybiotykami w leczeniu lekoopornych infekcji bakteryjnych, a inne glikopeptydy są często stosowane w celu stymulacji układu odpornościowego.Ponadto, ponieważ wiele antygenów drobnoustrojów jest glikozylowanych, ogromne znaczenie ma badanie glikopeptydów pod kątem poprawy efektu terapeutycznego infekcji.Z drugiej strony odkryto, że białka błony komórkowej komórek nowotworowych wykazują nieprawidłową glikozylację, co sprawia, że glikopeptydy odgrywają ważną rolę w badaniach nad nowotworami i obroną immunologiczną nowotworów.Glikopeptydy wytwarza się metodą Fmoc/t-Bu.Glikozylowane reszty, takie jak treonina i seryna, są często wprowadzane do polipeptydów przez fMOC aktywowane estrem pentafluorofenolu w celu ochrony glikozylowanych aminokwasów.
6. Izopren
Izopentadienylacja zachodzi na resztach cysteiny w łańcuchu bocznym w pobliżu C-końca.Izopren białkowy może poprawiać powinowactwo do błony komórkowej i tworzyć interakcję białko-białko.Białka izopentadienowane obejmują fosfatazę tyrozynową, małą GTazę, cząsteczki kochaperonu, blaszkę jądrową i centromerowe białka wiążące.Polipeptydy izoprenowe można wytwarzać stosując izopren na żywicach lub przez wprowadzenie pochodnych cysteiny.
7. Modyfikacja glikolem polietylenowym (PEG).
Modyfikację PEG można zastosować w celu poprawy stabilności hydrolitycznej białek, biodystrybucji i rozpuszczalności peptydów.Wprowadzenie łańcuchów PEG do peptydów może poprawić ich właściwości farmakologiczne, a także hamować hydrolizę peptydów przez enzymy proteolityczne.Peptydy PEG przechodzą przez przekrój poprzeczny naczyń włosowatych kłębuszków łatwiej niż zwykłe peptydy, znacznie zmniejszając klirens nerkowy.Ze względu na wydłużony aktywny okres półtrwania peptydów PEG in vivo, normalny poziom leczenia można utrzymać przy niższych dawkach i rzadszych lekach peptydowych.Jednak modyfikacja PEG ma również negatywne skutki.Duże ilości PEG zapobiegają degradacji peptydu przez enzym, a także zmniejszają wiązanie peptydu z docelowym receptorem.Jednak niskie powinowactwo peptydów PEG jest zwykle równoważone ich dłuższym farmakokinetycznym okresem półtrwania, a dzięki dłuższej obecności peptydów PEG w organizmie istnieje większe prawdopodobieństwo ich wchłonięcia do tkanek docelowych.Dlatego specyfikacje polimerów PEG powinny zostać zoptymalizowane w celu uzyskania optymalnych wyników.Z drugiej strony peptydy PEG gromadzą się w wątrobie na skutek zmniejszonego klirensu nerkowego, co powoduje zespół makromolekularny.Dlatego modyfikacje PEG należy projektować ostrożniej, gdy peptydy są wykorzystywane do testowania leków.
Typowe grupy modyfikacji modyfikatorów PEG można z grubsza podsumować w następujący sposób: Amino (-amina) -NH2, aminometylo-Ch2-NH2, hydroksy-OH, karboksy-Cooh, sulfhydryl (-Tiol) -SH, Maleimid -MAL, węglan sukcynimidu - SC, octan sukcynoimidu -SCM, propionian sukcynoimidu -SPA, n-hydroksysukcynimid -NHS, akrylan-ch2ch2cooh, aldehyd -CHO (taki jak propionald, butyrALD), baza akrylowa (-akrylan-akrl), azydoazydek, biotynyl - Biotyna, fluoresceina, glutaryl -GA, hydrazyd akrylanu, alkinoalkin, p-toluenosulfonian -OT, bursztynian sukcynoimidu -SS itp. Pochodne PEG z kwasami karboksylowymi można sprzęgać z n-końcowymi aminami lub bocznymi łańcuchami lizyny.Aminoaktywowany PEG można sprzęgać z łańcuchami bocznymi kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowego.Nieprawidłowo aktywowany PEG można sprzęgać z merkaptanem całkowicie odbezpieczonych łańcuchów bocznych cysteiny [11].Modyfikatory PEG są powszechnie klasyfikowane w następujący sposób (uwaga: mPEG to metoksy-PEG, CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH):
(1) modyfikator PEG o prostym łańcuchu
MPEG-SC, mPEG-SCM, mPEG-SPA, mPEG-OTs, MPEG-SH, mPEG-ALD, mPEG-butyrALD, mPEG-SS
(2) dwufunkcyjny modyfikator PEG
HCOO-PEG-COOH, NH2-PEG-NH2, OH-PEG-COOH, OH-PEG-NH2, HCl·NH2-PEG-COOH, MAL-PEG-NHS
(3) rozgałęziony modyfikator PEG
(mPEG)2-NHS, (mPEG)2-ALD, (mPEG)2-NH2, (mPEG)2-MAL
8. Biotynizacja
Biotyna może być silnie związana z awidyną lub streptawidyną, a siła wiązania jest nawet bliska wiązaniu kowalencyjnemu.Peptydy znakowane biotyną są powszechnie stosowane w testach immunologicznych, histocytochemii i cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji.Do wiązania biotynylowanych peptydów można również zastosować znakowane przeciwciała antybiotynowe.Etykiety biotynowe są często przyłączone do bocznego łańcucha lizyny lub do końca N.Kwas 6-aminokapronowy jest często stosowany jako wiązanie pomiędzy peptydami i biotyną.Wiązanie jest elastyczne w wiązaniu z podłożem i wiąże się lepiej w obecności przeszkody przestrzennej.
9. Etykiety fluorescencyjne
Znakowanie fluorescencyjne można wykorzystać do śledzenia polipeptydów w żywych komórkach oraz do badania enzymów i mechanizmów działania.Tryptofan (Trp) jest fluorescencyjny, dlatego można go stosować do wewnętrznego znakowania.Widmo emisyjne tryptofanu zależy od środowiska peryferyjnego i zmniejsza się wraz ze zmniejszaniem się polarności rozpuszczalnika, co jest właściwością przydatną do wykrywania struktury peptydu i wiązania receptora.Fluorescencję tryptofanu można wygasić za pomocą protonowanego kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego, co może ograniczać jego zastosowanie.Grupa chlorku dansylu (Dansyl) jest silnie fluorescencyjna, gdy jest związana z grupą aminową i jest często używana jako znacznik fluorescencyjny dla aminokwasów lub białek.
Rezonans fluorescencyjny Konwersja energii (FRET) jest przydatna w badaniach enzymatycznych.Gdy stosuje się FRET, polipeptyd substratu zwykle zawiera grupę znakującą fluorescencję i grupę wygaszającą fluorescencję.Znakowane grupy fluorescencyjne są wygaszane przez wygaszacz poprzez niefotonowy transfer energii.Kiedy peptyd ulega oddzieleniu od danego enzymu, grupa znakująca emituje fluorescencję.
10. Polipeptydy klatkowe
Peptydy klatkowe mają optycznie usuwalne grupy ochronne, które chronią peptyd przed związaniem się z receptorem.Pod wpływem promieniowania UV peptyd ulega aktywacji, przywracając mu powinowactwo do receptora.Ponieważ tę aktywację optyczną można kontrolować w zależności od czasu, amplitudy lub lokalizacji, peptydy klatkowe można wykorzystać do badania reakcji zachodzących w komórkach.Najczęściej stosowanymi grupami ochronnymi dla polipeptydów klatkowych są grupy 2-nitrobenzylowe i ich pochodne, które można wprowadzić do syntezy peptydów poprzez ochronne pochodne aminokwasów.Opracowane pochodne aminokwasów to lizyna, cysteina, seryna i tyrozyna.Pochodne asparaginianu i glutaminianu nie są jednak powszechnie stosowane ze względu na ich podatność na cyklizację podczas syntezy i dysocjacji peptydów.
11. Peptyd poliantygenowy (MAP)
Krótkie peptydy zwykle nie są odporne i muszą być sprzężone z białkami nośnikowymi, aby wytworzyć przeciwciała.Peptyd poliantygenowy (MAP) składa się z wielu identycznych peptydów połączonych z jądrami lizyny, które mogą specyficznie wyrażać immunogeny o dużej sile i mogą być stosowane do wytwarzania kupletów peptyd-białko nośnikowe.Polipeptydy MAP można syntetyzować metodą syntezy w fazie stałej na żywicy MAP.Jednakże niepełne sprzęganie powoduje brak lub skrócenie łańcuchów peptydowych na niektórych rozgałęzieniach, a zatem nie wykazuje właściwości oryginalnego polipeptydu MAP.Alternatywnie, peptydy można wytwarzać i oczyszczać oddzielnie, a następnie sprzęgać z MAP.Sekwencja peptydowa przyłączona do rdzenia peptydowego jest dobrze zdefiniowana i łatwa do scharakteryzowania za pomocą spektrometrii mas.
Wniosek
Modyfikacja peptydów jest ważnym sposobem projektowania peptydów.Chemicznie modyfikowane peptydy mogą nie tylko zachować wysoką aktywność biologiczną, ale także skutecznie uniknąć wad związanych z immunogennością i toksycznością.Jednocześnie modyfikacja chemiczna może nadać peptydom nowe, doskonałe właściwości.W ostatnich latach szybko rozwinęła się metoda aktywacji CH w celu późniejszej modyfikacji polipeptydów i uzyskano wiele ważnych wyników.
Czas publikacji: 20 marca 2023 r